【摘要】  目的：探讨大黄素对膀胱癌BIU-87细胞增殖的抑制作用及其可能机制。方法：采用倒置显微镜观察细胞生长,DAPI染色观察凋亡细胞；以及CCK-8法检测不同浓度的大黄素在不同作用时间下对人类膀胱癌BIU-87细胞增殖的抑制作用；采用JC-1检测线粒体跨膜电位并衡量线粒体去极化的比例以及caspase-9活性检测证实大黄素诱导BIU-87细胞凋亡的作用机制。结果：不同浓度(10、20、40、60和80μmol/L)的大黄素均可抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖，而且抑制率呈浓度依赖和时间依赖关系；大黄素作用BIU-87细胞24、48、72小时后半数抑制浓度（IC50）分别为：（46.27±2.32）μmol/L、（34.79±1.75）μmol/L、（25.58±1.24）μmol/L。随大黄素作用时间以及剂量的增加，BIU-87细胞凋亡率增加，线粒体跨膜电位逐渐下降（P＜0.05），作用12小时后caspase-9活性随药物浓度增加而增加。结论：大黄素能有效地抑制人类膀胱癌BIU-87细胞株的生长，其可能机制为通过线粒体通路诱导细胞凋亡。

【Abstract】 Objective: To investigate the inhibitory effect of emodin on the proliferation of human bladder cancer cell line BIU-87 in vitro and the possible mechanism. Methods: The cell growth was observed by inverted microscope，DAPI staining was used to detect morphological changes of apoptotic cells;CCK-8 assay was used to observe different concentration of emodin inhibition of BIU-87 cell proliferation at different time; The mitochondrial membrane potential and the proportion of mitochondrial depolarization were measured by the fluorescent probe JC-1;Caspase-9 Activity Assay Kit was used to confirmed the apoptosis mechanism of emodin on the BIU-87 cell. Results: Different concentration (10, 20, 40, 60, and 80 μmol/L) emodin all can inhibit the proliferation of human bladder cancer BIU-87 cell, and the inhibition rate were concentration-dependent and time-dependent; half maximal  inhibitory concentration （IC50）of emodin were （46.27±2.32）μmol/L,（34.79±1.75）μmol/L,（25.58±1.24）μmol/L after 24h,48h and 72h.In addition, DAPI staining had detected the typical apoptotic morphological changes such as nuclear condensation, nuclear fragmentation and formation of apoptotic body;JC-1 assay showed the mitochondrial membrane potential was decreased significantly (P<0.05);After 12 hours, activity of caspase-9 was increased with the concentration. Conclusion: Emodin can effectively restrain the growth of human bladder cancer BIU-87 cell, and the possible mechanism was introduced through the mitochondria pathways apoptosis.

【关键词】大黄素；膀胱癌；增殖抑制；凋亡

【Key words】emodin； human bladder cancer； inhibition of proliferation； apoptosis

 

大黄素（Emodin）化学名为1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，分子式：C15H10O5，分子量为270.23，是中药大黄的主要有效成分之一，在虎杖、何首乌、望江南及百合等多种中药中含量也很丰富。研究表明大黄素对于肺腺癌细胞[[[] Su YT, Chang HL, Shyue SK, et al. Emodin induces apoptos is in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species-dependent mitochondrial signaling pathway [J].Biochem Pharmacol,2005,70(2): 229-241.]]、人神经胶质细胞[[[]Chen YY；Chiang SY；Lin JG；et al . Emodin, aloe-emodin and rhein inhibit migration and invasion in human tongue cancer SCC-4 cells through the inhibition of gene expression of matrix metalloproteinase-9. [J] Int J Oncol.2010V36N5 :1113-1120]]、人类慢性粒细胞白血病细胞[[[] Wang Chun-Guang, Yang Jun-Qing, Liu Bei-Zhong et al  Anti-tumor activity of emodin against human chronic myelocytic leukemia K562 celllines in vitro and in vivo［J］European Journal of Pharmacology 627 (2010) 33–41.]]、人直肠癌细胞[[[] Yi-Shih Maa,b, Shu-Wen Wenga, Meng-Wei Lin et.al  Antitumor effects of emodin on LS1034 human colon cancer cells in vitro and in vivo: Roles of apoptotic cell death and LS1034 tumor xenografts model ［J］ Food and Chemical Toxicology 50 (2012) 1271–1274]]等的生长具有抑制作用，但目前大黄素抗肿瘤的作用机理尚不明确。大黄素对于膀胱癌细胞增殖的作用尚未见报道，本研究拟观察大黄素对膀胱癌细胞增殖的抑制及凋亡诱导作用，现将实验结果报道如下。

1.实验材料和仪器

1．1 实验材料：人类膀胱癌细胞株BIU-87购自中国科学院上海分院细胞生物研究所。胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，大黄素粉剂购自北京鼎国公司，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品，2.5% EDTA-胰酶购自美国Gibco公司，苏木素、伊红染液购于北京中杉金桥公司，CCK-8试剂盒、DAPI检测液、JC-1试剂盒、caspase-9活性检测试剂盒购自江苏碧云天生物公司。大黄素以DMSO配制为16mmol/L的溶液作为母液存于-20℃避光保存，使用时取适量用培养基稀释至相应浓度（终浓度≤0.05%）。

 1.2 主要仪器：细胞培养箱（日本SANYO公司）、超净工作台（苏州净化设备厂）、倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)、倒置显微镜(日本Nikon公司)、微量移液器(德国Eppendorff公司)、-20℃冰箱(中国海尔集团)、低温冰箱(美国Thermo Forma公司)、多功能酶标仪(美国AWARENESS公司)、台式离心机(湘仪离心机仪器有限公司)、低温高速离心机(德国Eppendorf公司)、恒温水浴箱(上海第七仪器厂)

2. 实验方法

 2.1 细胞培养：BIU-87细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于5% CO2、37℃恒温恒湿的培养箱中。保持细胞呈单层贴壁生长，每2天以含2.5% EDTA的胰酶消化传代1次。

2.2 大黄素对BIU-87细胞生长状况和形态学的影响：将对数生长期的细胞按5×104个/ml滴加于内置盖玻片的6孔板中央，待细胞贴壁培养至适当的密度后，给药组加入含不同浓度(10、20、40、60和80μmol/L)大黄素的细胞培养液2ml，空白对照组加入等体积的培养液，阴性对照组为含0.05%DMSO的细胞培养液。分别在培养24、48、72小时后，用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态学改变。

2.3 DAPI染色检测细胞凋亡：将对数生长期的细胞按5×104/ml接种三块于6孔板中（培养液不含血清），培养24小时后给药组加入含不同浓度(10、20、40、60和80μmol/L)大黄素的细胞培养液2ml，空白对照组加入等体积的培养液，阴性对照组为含0.05%DMSO的细胞培养液。继续培养24、48、72小时，PBS漂洗2次；加入适量 DAPI 溶液室温避光作用5min；吸弃DAPI染色液，然后用PBS洗涤三次。荧光显微镜下以350nm紫外光激发，观察、拍照。

2．4 大黄素对BIU-87细胞增殖的影响：收集处于对数生长期的BIU-87细胞，制成单细胞悬液，以每孔2×104/ml个细胞接种到96孔板，同时设置空白调零组（不加细胞加入等量的PBS)以及阴性对照组（不含药物）。设8个复孔，计算时分别去除最大值和最小值。细胞贴壁后，以不同浓度大黄素(10、20、40、60、80μmol/L)处理。分别于药物作用24、48、72小时后PBS洗板两次，每孔加入90μL培养液及CCK-8检测试剂10μL，继续培养2小时，于波长450 nm（650nm为参考）处测出用药后24、48、72小时各孔吸光度值(OD值)，并计算细胞生长抑制率(％) =1-(实验组平均OD值-空白调零组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白调零组平均OD值)×100％。

2.5 线粒体跨膜电位检测及线粒体去极化评估：取5×104个/ml的活细胞接种于三块6孔培养板中，调整细胞周期24小时后，分别加入不同浓度（0、10、20、40、60、80μmol/L）的药物培养24、48、72小时，阴性对照组为含0.05%DMSO的细胞培养液。提前20分钟在一个未加药物孔中加入20μL CCCP作为阳性对照。PBS洗板后，滴加1ml培养液和1ml JC-1工作液于各孔中，继续放入37℃，5%CO2的培养箱中孵育20min；4℃ JC-1缓冲液（1×）洗板两次后加入2mL培养液，在荧光显微镜下观察拍照并计算红、绿荧光相对比例。

2.6 caspase-9活性检测：取2×105个/ml的活细胞4ml接种于7个培养瓶中，调整细胞周期24小时后，分别加入不同浓度（0、10、20、40、60、80μmol/L）的药物培养12小时，阴性对照组为含0.05%DMSO的细胞培养液。吸取细胞培养液，备用。PBS洗2遍，用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟，收集细胞，吸除上清，PBS洗涤一次。吸尽上清后，加入100微升裂解液重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。4℃ 20000g离心13分钟。把上清转移至冰浴预冷的离心管中。取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，测得蛋白浓度为1.8g/L。取一96孔板，先后加入检测缓冲液60μl、待测样品30μl、Ac-LEHD-pNA(2mmol/L) 10μl并设一空白对照（90μl检测缓冲液加 10μl Ac-LEHD-pNA混匀后，37℃孵育120分钟。把试剂盒提供的pNA (10mmol/L)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μmol/L，作为标准品。每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，测定A405，制作pNA浓度的标准曲线。通过对比标准曲线以计算样品的pNA浓度。

2.7 统计学处理：采用SPSS 17.0软件进行，所得数据以均值±标准差表示，两组之间比较采用t检验，以P＜0.05时认为有统计学意义。

3.结果

3．1  BIU-87细胞的形态学变化：倒置显微镜下观察，随着大黄素作用浓度和作用时间和增加，BIU-87细胞形态逐渐变圆或者不规则，胞内空泡增多，部分细胞脱壁并漂浮。而未加药物的对照组细胞呈上皮型，贴壁生长，细胞轮廓清楚，胞质中无异常颗粒出现，增殖旺盛(图一)。

图一：大黄素作用于BIU-87细胞24小时后镜下图像

（倒置显微镜×200倍）

1.changes of BIU-87  after 24 hours induced by emodin(200×)

 

A.空白对照组（未加药物）：细胞呈上皮型，贴壁生长，细胞轮廓清楚，胞质中无异常颗粒出现；B.阴性对照组（0.05%DMSO）：细胞数量及形态均与空白对照组相近；C.大黄素20μmol/L组：细胞数量略减少，形态规则，胞内可见少量小空泡，；D.大黄素40μmol/L组：，细胞数量明显减少，胞内空泡增多，细胞形态不规则，部分细胞脱壁并漂浮；E. 大黄素60μmol/L组：细胞数量减少，细胞形态不规则，胞内空泡大且多；F.大黄素80μmol/L：细胞数量减少明显，形态呈多样，胞内空泡多，大量出芽现象。

3．2  DAPI染色结果：DAPI染色后置于荧光显微镜下观察，出现细胞核浓缩和核碎片的细胞被判定为凋亡细胞。如图二所示：DAPI染色后对照组细胞核呈浅蓝色染色，细胞核规则，呈圆形。药物作用后细胞凋亡明显增多，凋亡细胞呈现核浓缩，染色加深，或核染色质呈新月形聚集于核膜一边层不规则形态。

图二：DAPI染色法显示大黄素作用24小时后BIU-87凋亡细胞核

（倒置荧光显微镜×200倍）

2.changes of nuclear detected by DAPI staining after 24 hours induced by emodin(200×)

 

A.空白对照组（未加药物）：活细胞染色产生较弱的蓝色荧光，偶见自然凋亡细胞；B.阴性对照组（0.05%DMSO）：可见核浓缩，染色加深的凋亡细胞；C.大黄素20μmol/L组：凋亡细胞增多；D.大黄素40μmol/L组：凋亡细胞增多，细胞核趋于不规则；E. 大黄素60μmol/L组：约半数细胞出现染色加深、核碎裂、核浓缩的凋亡细胞；F.大黄素80μmol/L：染色加深、核碎裂、核浓缩或凋亡小体的凋亡细胞明显增多。

3.3  CCK-8法检测细胞增殖：大黄素对BIU-87细胞的增殖具有明显的抑制作用。不同浓度下细胞处理前后的生长抑制率均存在显著性差异(P＜0.0l，见图三)；大黄素作用24小时后各给药组的增殖抑制率分别为（4.67±0.23）%、（11.89±0.37）%、（43.56±1.09）%、（62.76±2.35）%、（67.54±4.28）%，说明大黄素对BIU-87细胞的作用具有浓度依赖性。20μmol/L的大黄素作用24、48、72小时增殖抑制率分别为（11.89±0.37）%、（22.35±0.72）%、（36.67±1.46）%。大黄素作用BIU-87细胞24、48、72小时后半数抑制浓度（IC50）分别为：（46.27±2.32）μmol/L、（34.79±1.75）μmol/L、（25.58±1.24）μmol/L。表明大黄素的抑制作用具有时间依赖性.

图三：大黄素作用于BIU-87细胞的相对增殖抑制率

3.the inhibition on BIU-87 cells at various concentrations

 

实验分组

 n BIU-87细胞增殖抑制率（%）

24h 48h 72h

空白对照 6 0% 0% 0%

阴性对照 6 （1.42±0.64）% （1.63±0.53）% (1.18±0.73%)

10μmol/L 6 （4.67±0.23）% * （7.55±0.30）% ** （10.27±0.82）% **

20μmol/L 6 （11.89±0.37）% ** （22.35±0.72）% ** （36.67±1.46）% **

40μmol/L 6 （43.56±1.09）% ** （54.83±2.45）% ** （75.13±1.63）% **

60μmol/L 6 （62.76±2.35）% ** （73.70±1.85）%** （87.43±2.76）% **

80μmol/L 6 （67.54±4.28）% ** （80.83±3.56）% ** （94.23±5.53）% **

注：统计结果为各组与阴性对照组同期比较，*P＜0.05， ** P＜0.01

 

大黄素作用24、48、72 h后，各给药组OD值均明显低于对照组，通过计算增殖抑制率并进行统计学t检验，证明药物作用不同剂量及不同作用时间增殖抑制率差异有统计学意义(*为P＜0．05，**为P＜0．01)。

3.4  JC-1法检测线粒体跨膜电位：不同浓度大黄素处理膀胱癌BIU-87细胞线粒体膜电位改变明显（图四），细胞总数随时间增长而减少，红、绿荧光相对比例随时间增长而减小(图五)，随剂量增加而减小，去极化率增高同样有浓度和时间依赖性。

图四  JC-1法检测经不同浓度大黄素处理膀胱癌BIU-87细胞24小时线粒体膜电位（倒置荧光显微镜×100倍）

4.mitochondrial membrane potential detected by JC-1 after 24 hours induced by emodin

    A．阴性对照组（0.05%DMSO）：BIU-87细胞产生大量红色荧光（正常极化的线粒体膜电位）B.空白对照组（未加药物）：BIU-87细胞产生大量红色荧光（正常极化的线粒体膜电位）；C.大黄素10μmol/L组：经药物作用，少量细胞线粒体膜电位出现去极化，表现为绿色荧光；D.大黄素20μmol/L组：绿色荧光增多；E.大黄素40μmol/L组：多数细胞出现绿色荧光，细胞总量减少；F.大黄素60μmol/L组大黄素组：细胞均产生绿色荧光，形态尚可。G.大黄素80μmol/L组大黄素：所有细胞产生绿色荧光，细胞数量明显减少，细胞形态趋于不规则；H.阳性对照组（加入CCCP）：细胞全部绿色荧光，细胞线粒体膜被破坏后，JC-1以单体形式存在产生绿色荧光（线粒体膜电位去极化）。

图五：JC-1法测BIU-87细胞线粒体膜电位去极化比例

5.ratio of mitochondrial depolarization detected by JC-1 induced by emodin

实验分组 n BIU-87细胞线粒体膜电位去极化比例平均值（%）

24h 48h 72h

空白对照 5 （1.5±0.4）% （2.1±0.6）% （1.5±0.5）%

阴性对照 5 （1.5±0.4）% （1.8±0.4）% （2.2±0.6）%

10μmol/L 5 （4.0±0.8）% * （7.6±0.5）% ** （10.0±1.1）% **

20μmol/L 5 （11.5±1.8）% ** （26.8±3.6）% ** （43.7±5.4）% **

40μmol/L 5 （56.5±4.3）% ** （74.0±2.9）% ** （85.3±3.2）% **

60μmol/L 5 （87.0±0.8）% ** （92.6±1.2）% ** （96.4±1.7）% **

80μmol/L 5 （94.1±1.2）% ** （96.5±1.4）% ** （97.2±1.8）% **

大黄素作用24、48、72 h后，各给药组线粒体膜电位去极化比例均明显高于对照组，通过计算去极化比例并进行统计学t检验，证明药物作用不同剂量及不同作用时间线粒体跨膜电位去极化差异有统计学意义(*为P＜0．05，**为P＜0．01)。

3.5  caspase-9相对活性检测：不同浓度大黄素作用12小时后，BIU-87细胞caspase-9的相对活性为1.11±0.06、1.33±0.06、2.47±0.08、4.04±0.07、5.38±0.12（图六），可以看出在较高浓度的药物（40μmol/L）作用下，caspase-9的活性增加明显，差异具有统计学意义（P＜0.01﹚。

 

图六：大黄素作用12小时后caspase-9相对活性

6.activity of caspase-9 after 12 hours induced by emodin

 

 

大黄素作用12 h后，各给药组OD值均高于对照组，通过计算pNA产生量并进行统计学t检验，证明不同剂量药物作用后膀胱癌BIU-87细胞内部的caspase-9相对活性差异有统计学意义(*为P＜0．05，**为P＜0．01)。

4.讨论

膀胱癌是泌尿系统中发病率最高的肿瘤，也是国内排名前十的常见恶性肿瘤，临床治疗主要以手术为主，辅以灌注化疗和放疗[[[]吴在德，吴肇汉主编，外科学 第7版［M］北京：人民卫生出版社，2010:691-694.]]，寻找能够有效抑制膀胱癌细胞增殖与扩散的药物对于无法耐受手术的患者非常重要。细胞凋亡作为细胞死亡的一种重要形式，对维持机体正常发展和保证体内平衡有着重要作用。细胞凋亡紊乱，导致肿瘤无限制增殖是肿瘤发生发展的重要原因之一。大黄素是最先从大黄中提取的一种天然蒽醌类衍生物，是一种酪氨酸激酶抑制剂[[[]Cozza G；Mazzorana M；Papinutto E et al . Quinalizarin as a potent, selective and cell- permeable inhibitor of protein kinase CK2. [J] Biochem J.2009V421N3 :387-395]]，它在诱导肿瘤细胞凋亡[[[] Zhiwei Huang, Guichen Chen, Ping Shi .Emodin-induced Apoptosis in Human Breast Cancer BCap-37 Cells through the Mitochondrial Signaling Pathway. [J] Arch Pharm Res 2008,31(6):742-748.]]、抗肿瘤药物增敏[[[] Wei W, Guo Y, Chen H.et.al  Emodin enhances antitumor effect of gemcitabine in model of SW1990 cell xenograft on athymic mouse. ［J］ Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2010.35(24):3348-3353.]]、抑制肿瘤血管生成[[[] LuY, Zhang J, Qian J. The effect of emodin on VEGF receptors in human colon cancer cells. [J].Cancer Biother Radiopharm,2008, 23(2):222-228.]]等方面的作用受到广泛关注。大黄素抗肿瘤的作用主要是诱导细胞通过线粒体凋亡途径实现凋亡的[[[] Lin Shunyuan, Lai Wanwei, Ho Chinchin et al.Emodin induces apoptosis of human tongue squamous cancer SCC-4 cells through reactive Oxygen specis and mitochondria-dependent pathways[J]Anticancer Reserch,2009,29,327-336.],[[] Yu-Ting Su ,Huei-Ling Chang, Song-Kun Shyue et al Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species-dependent mitochondrial signaling pathway. [J] Biochemical Pharmacology 70 (2005) 229–241.],[[]Wei W；Guo Y；Chen H, et al. Emodin enhances antitumor effect of gemcitabine in model of SW1990 cell xenograft on athymic mouse. ［J］ Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.2010V35N24 :3348-3353 ]]，线粒体凋亡的主要过程[[[]查锡良主编 医学分子生物学 第1版［M］.北京：人民卫生出版社，2010:522-523.]]包括，线粒体膜通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore，MPT）开放，外膜破坏后释放细胞色素C，细胞色素C与胞浆接头蛋白Apaf-1结合并促进Apaf-1寡聚化，Apaf-1选择性的直接募集多个caspase-9[[[]Chen YY；Chiang SY；Lin JG；et al . Emodin, aloe-emodin and rhein inhibit migration and invasion in human tongue cancer SCC-4 cells through the inhibition of gene expression of matrix metalloproteinase-9. [J] Int J Oncol.2010V36N5 :1113-1120]]分子并引起caspase-9变构活化，活化的caspase-9分子再激活下游包括caspase-3，caspase-6等凋亡效应分子，最终导致细胞凋亡。大黄素其他作用机制包括：下调雄激素受体[[[] Cha TL, Qiu L, Chen CT et al. Emodin down-regulates androgen receptor and inhibits prostate cancer cell growth. [J]Cancer Res. 2005.65(6):2287-2295.]]、诱导P53依赖性凋亡途径 [[[]Lai JM；Chang JT；Wen CL；Hsu SL ；Emodin induces a reactive oxygen species- dependent and ATM-p53-Bax mediated cytotoxicity in lung cancer cells. [J] Eur J Pharmacol.2009V623N1-3 :1-9]]、抑制基质金属蛋白酶（MMP-9）分泌 [[[]Chen YY；Chiang SY；Lin JG；et al . Emodin, aloe-emodin and rhein inhibit migration and invasion in human tongue cancer SCC-4 cells through the inhibition of gene expression of matrix metalloproteinase-9. [J] Int J Oncol.2010V36N5 :1113-1120]]等机制抑制肿瘤生长及转移。

本实验通过药物干预后对细胞形态学的观察，计算大黄素对BIU-87细胞增殖的抑制率，可以初步估算大黄素的药物量效关系。通过检测线粒体跨膜电位并衡量线粒体去极化的比例发现线粒体跨膜电位在大黄素作用后去极化明显。通过对线粒体通路凋亡下游第一个caspase的相对活性检测，结合文献，可以判断大黄素作用后线粒体的改变以及由此引起的caspase活性增加等一系列变化，是大黄素抑制膀胱癌BIU-87细胞增殖的主要机制之一。对该机制的研究可以为膀胱癌的药物治疗提供一定的研究基础，亦为大黄素的抗肿瘤效应提供更多的依据。