【摘要】目的：研究板蓝根活性单体-5b逆转乳腺癌耐药株MCF-7/ADR细胞的作用及逆转机理。方法：选取人乳腺癌MCF-7细胞及耐药株MCF-7/ADR细胞作为主要研究细胞，在两种细胞中加入活性单体-5b,采用MTT法观察活性单体-5b对多药耐药(MDR)逆转作用；采用FCM法观察阿霉素对两种细胞的抑制浓度及倍数。结果：当活性单体-5b的剂量低于150µmol/L时，其对两种细胞无毒性作用；活性单体-5b能提高MCF-7／ADR细胞的凋亡率；活性单体-5b能增加阿霉素在体内的积累。结论：活性单体-5b对MCF-7／ADR细胞的MDR具有一定的逆转作用，是一种有效的乳腺癌化疗增敏剂。

【关键词】活性单体-5b；MCF-7；MCF-7/ADR；逆转

临床上，乳腺癌是一种女性常见的疾病，且发病率有逐年上升的趋势。乳腺癌细胞中存在大量的多药耐药细胞株(MDR)，MDR能显著降低化疗药物的敏感性，影响化疗的治疗效果[1]。板蓝根是菘蓝的根，其提取出来的活性物质具有较强的免疫激活功能，能显著增强化疗药物阿霉素等的敏感性，增加化疗药物在癌细胞中的蓄积，提高药效，而且其对细胞的毒副作用小。本文主要研究板蓝根提取物5b对乳腺癌耐药细胞株MCF-7ADR的耐药逆转作用及逆转机理，为乳腺癌的治疗提供依据。

1仪器及细胞株

1.1仪器来源

活性单体-5b为天津中医药大学提供，主要采用溶剂浸提法从中药板蓝根中分离提纯获得，纯度高达98%。阿霉素及碘化吡啶由北京中山医药公司提供；1640细胞培养基、流式细胞仪由上海明治公司提供；CO2培养箱及显微镜由北京生物公司提供。

1.2细胞株来源

人乳腺癌细胞株MCF-7及其耐药细胞株MCF-7/ADR由中山肿瘤医院实验室提供，MCF-7/ADR细胞株的耐药倍数是MCF-7细胞株的80倍。

2.实验方法

2.1细胞培养

    MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞采用DMEM培养液在1640细胞培养基中培养，培养液中有100U/ml的链霉素、100U/ml的青霉素、12%的小牛血清；培养环境中有5%的CO2、保持在37℃左右、湿度适宜，2天进行一次传代。

2.2MTT法检测[2]

    本研究采用MTT法检测活性单体-5b对MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞生长的安全浓度，并观察MCF-7/ADR的多药耐药细胞株MDR生长的抑制功能及逆转作用。耐药倍数及逆转倍数根据以下公式确定：耐药倍数= IC50(MCF-7/ADR细胞株)/IC50(MCF-7细胞株)，本研究中MCF-7/ADR细胞株的耐药倍数是MCF-7细胞株的80倍；逆转倍数= IC50(阿霉素作用组)/IC50(活性单体-5b与阿霉素作用组)。

2.3FCM法检测[3]

本研究采用FCM法检测MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞的凋亡率，并观察细胞中阿霉素的含量。细胞中阿霉素含量的测定方法：蒽环类药物一般都会发出荧光，可以采用流式细胞仪对细胞中阿霉素的含量进行测定。选取106个对数生长期的细胞,加入2.4mg/L的活性单体-5b以及5μmol/L 的阿霉素，在 37℃的保温箱中保温1h，将细胞收集后调整转速为1500 rpm进行2 min的离心处理，采用新的DMEM培养液对细胞进行清洗；再放入37℃保温箱中进行10 min左右的保温,再次采用新的DMEM培养液对细胞进行清洗，放在新的、冰冷的DMEM培养液中使用488nm的激发光对细胞的荧光强度进行检测。

3.统计学处理

本研究采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理，采用Cell Quest Plot软件对细胞数目进行计量，组间均数比较t检验。P<0.05时，数据差异具有统计学意义。

4结果

4.1 MTT法检测结果

   采用 MTT法检测发现，在MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞中加入低于150µmol/L的活性单体-5b时，活性单体-5b对两种细胞均无毒副作用。IC50（MCF-7细胞）=0.14±0.02，IC50（MCF-7/ADR细胞）=15.74±0.08,耐药倍数均为112。将两种细胞加入150µmol/L以下浓度的的活性单体-5b中培养48h后，MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞的IC50均有不同程度的下降，但MCF-7/ADR细胞的IC50下降更为明显，逆转倍数增高明显，且逆转倍数随着活性单体-5b浓度的增加而增高，与之相应的逆转率也升高明显，两种细胞逆转倍数及逆转率比较差异具有统计学意义( P<0.05)。比较见表1。

表1  活性单体-5b对两种细胞的IC50作用及耐药逆转比较

活性单体-5b浓度（µmol/L） 0 15.8 31.5 63.0 125

MCF-7 0.14±0.02 0.12±0.04 0.21±0.04 0.13±0.05   0.10±0.01

MCF-7/ADR 15.74±0.08 14.29±0.01 11.03±0.03 7.18±0.10 2.33±0.02

逆转倍数   - 1.20 1.44 2.18 6.68

逆转率 - 9.28 30.18 54.88   85.97

4.2 FCM法检测结果

4.2.1细胞凋亡率

    在MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞中加入阿霉素与活性单体-5b共同作用后， FCM法检测发现，与MCF-7细胞的凋亡率相比，MDR的凋亡率升高的速度更快，见表2。在150µmol/L以下浓度的的活性单体-5b范围内，随着活性单体-5b浓度的增加，MDR的凋亡率升高的速度随之加快，凋亡率增加差异比较具有统计学意义（P<0.01）。

表2  活性单体-5b对MCF-7细胞及MCF-7/ADR细胞凋亡率影响比较

活性单体-5b浓度（µmol/L） 0 15.8 31.5 63.0 125

MCF-7 1.82±0.06 2.04±0.10 1.97±0.10   3.26±0.04   5.06±0.02

MCF-7/ADR 1.17±0.04 3.14±0.08 5.36±0.12 9.04±0.02 21.84±0.03

4.2.2 阿霉素含量变化情况 

    FCM法观察发现，MCF-7细胞在加入不同浓度的活性单体-5b时阿霉素荧光强度的改变差异比较无统计学意义（P>0.05）；MCF-7/ADR细胞在加入15.8、31.5µmol/L两种浓度的活性单体-5b时，阿霉素荧光强度的改变差异无统计学意义（P>0.05），但是在加入63.0、 125µmol/L两种浓度的活性单体-5b时，阿霉素荧光强度明显增加，差异比较有统计学意义（P<0.05）。由此可见，在加入63.0µmol/L以上，150µmol/L以下的活性单体-5b的情况下，阿霉素在细胞内的蓄积含量增加，对MDR的杀伤力也随之增强。

4 讨论

人体乳腺癌的多药耐药（MDR）能明显降低化疗药物的敏感性，影响化疗的效果，MDR数量的增多还可能导致化疗失败，因此在乳腺癌的治疗中应采取措施对MDR进行逆转，以提高化疗药物的敏感性。中药中有很多可以增加化疗药物敏感性的成分，如板蓝根提取物5b就是其中的一种。板蓝根提取物中的活性单体5b具有较强的免疫激活功能，并能在体外抑制癌细胞的活性。活性单体-5b作为一种亲脂化合物，其化学结构与MDR逆转剂的化学特征较为相似，能起到良好的逆转作用。

在研究中我们发现，在阿霉素中加入活性单体-5b，阿霉素在细胞内的蓄积含量增加，而阿霉素对MCF-7细胞以及MCF-7/ADR细胞的抑制作用也有所增强，特别是MCF-7/ADR细胞的凋亡率明显提升，这对乳腺癌的治疗带来新的希望。

【参考文献】

[1] 董宁宁,王明玉,张琼.吉西他滨联合卡培他滨治疗蒽环类和紫杉类药物耐药的转移性乳腺癌临床疗效分析[J]. 肿瘤防治研究. 2010,13(01):67-68.

[2] 张凤春,楼丽广,唐卫东等. 托瑞米芬和他莫昔芬对MCF7/ADR多药耐药的逆转作用[J]. 现代肿瘤医学. 2009,81(09):54-55.

[3] Toshiaki Saeki,Takashi Tsuruo,Wakao Sato,Kiyoshiro Nishikawsa. Drug resistance in chemotherapy for breast cancer[J] ,2008